Et mikro-RNA eller mi-RNA er et enkelttrådet RNA, mellom 21 og 25 nukleotider langt , som har evnen til å regulere uttrykket av andre gener gjennom forskjellige prosesser, ved å bruke ribointerferensveien . [ 1 ]
De ble opprinnelig beskrevet i 1993 av Rosalind Lee og kolleger i laboratoriet til Victor Ambros, [ 2 ] men begrepet "mikro-RNA" ble først laget i 2001 i et sett med tre artikler publisert i Science (26. oktober 2001). [ 3 ] Fra begynnelsen av 2008 antydet beregningsmessige analyser av IBM tilstedeværelsen av rundt 50 000 forskjellige mikroRNA-er i det menneskelige genomet , hver med kanskje så mange som tusenvis av potensielle mikroRNA-mål. [ 4 ]
Etter å ha oppdaget siRNA -er og eksistensen i celler av proteiner som katalyserer mRNA-nedbrytning, lurte forskerne på om siRNA-er også var kodet i genomet, og begynte å rense små RNA-er (19-25 nt) fra forskjellige dyrearter. De fant imidlertid ikke siRNA, men såkalte mikro-RNA, som tidligere var uavhengig identifisert. [ 2 ]
Mikro-RNA er RNA-molekyler som er transkribert fra DNA-gener, men som ikke blir oversatt til proteiner . De kommer til uttrykk i et bredt spekter av organismer, fra planter til ormer til mennesker . Mange mikro-RNA-er er godt bevart mellom arter, [ 6 ] og mange komponenter i mikro-RNA-maskineriet har blitt funnet selv i arkea og bakterier , og avslører deres svært gamle opprinnelse. Noen mikroRNA-tellinger hos mennesker identifiserte så mange som 800, noe som ville antyde at mikroRNA-er kunne representere minst 3 % av alle menneskelige gener. [ 7 ]
DNA-sekvensen som koder for et mikro-RNA-gen har en lengde som overstiger den endelige størrelsen på selve mikro-RNA-et og inkluderer mikro-RNA-regionen og en region som er komplementær til den forrige, som tillater paring. Dette innebærer at det under transkripsjonen av denne DNA-sekvensen dannes regioner som har evnen til å danne en hårnål og generere et langt primært dobbelttrådet RNA kjent som pri-mikro-RNA . Deretter kutter et kjernefysisk enzym kalt DROSHA basene til hårnålen, og danner det som kalles pre-mikro-RNA . Dette pre-mikro-RNA blir transportert fra kjernen til cytoplasmaet ved eksportin 5. Når pre-mikro-RNA er i cytoplasmaet, spaltes det av DICER -enzymet , som kutter det til den endelige lengden på 20-25 nukleotider ... [ 5 ]
Funksjonen til mikro-RNA er relatert til reguleringen av genuttrykk . På denne måten er et mikro-RNA komplementært til en del av en eller flere messenger-RNA (mRNA). Dyre-mikroRNA-er har en tendens til å vise ufullkommen komplementaritet med 3' UTR -regionen , og hemmer generelt mRNA-translasjon, mens plantemikroRNA-er har en tendens til å vise perfekt komplementaritet med kodende regioner og induserer spaltning og påfølgende nedbrytning av mål-mRNA (slik som skjer med siRNA- er hos dyr) . [ 5 ]
Før de ble klassifisert som en del av RNAi -veien , ble mikro-RNA først identifisert i ormer, der de regulerer utviklingsfaser , [ 8 ] men er nå kjent for å være involvert i en lang rekke prosesser i menneskekroppen . spiller også en rolle i nettverksbygging og finjustering av genuttrykk i cellen. [ 9 ] [ 6 ] Når antallet potensielle mål for mikroRNA øker til antall tusen (omtrent 30 % av menneskelige gener), kan mikroRNA utgjøre et annet lag av regulatoriske kretser som finnes i cellene. [ 10 ] Ifølge dette kan enhver deregulering av mikro-RNA føre til store reguleringsproblemer i cellen, kanskje indusere kreftfenotyper . Faktisk er det vist at ekspresjonsprofilene til mikroRNA er modifisert i et stort antall krefttyper [ 11 ] og at tvungen overekspresjon av mikroRNA kan føre til utvikling av svulster. [ 12 ]
Mikro-RNA-er blir transkribert fra forskjellige genomiske lokasjoner som lange primære transkripsjoner ( "pri-mikro-RNA ") av RNA -polymerase II. [ 13 ]
Mikro-RNA kan finnes på mange typer loci i genomet : [ 14 ]
Omtrent 50 % av mikro-RNA er i klynger av mikro-RNA som i utgangspunktet er kodet som et polycistronisk transkript (inkludert flere gener), [ 16 ] som deretter fragmenteres til flere mikro-RNA. I de fleste tilfeller deler polycistroniske mikroRNA det samme uttrykksmønsteret. Imidlertid ser de relative nivåene av mikro-RNA-ene i klyngen ut til å være regulert på en utviklings- og homeostaseavhengig måte , noe som tyder på en ennå udefinert kompleksitet i reguleringen av genuttrykk.
MikroRNA-kodende gener er mye lengre enn modne behandlede mikroRNA; mikro-RNA blir opprinnelig transkribert som primære transkripsjoner eller pri-mikro-RNA med en 5'- hette og en 3'-poly-adenin (poly-A) -hale og behandles i cellekjernen til korte 70 mm-strukturer. nukleotider kjent som pre-mikro-RNA. Hos dyr gjøres denne behandlingen av et proteinkompleks kalt mikroprosessoren, som består av nukleasen DROSHA [ 17 ] og det dobbelttrådede RNA-bindende proteinet, PASHA . [ 18 ] [ 19 ] Disse pre-mikroRNA-ene blir deretter behandlet til modne mikroRNA-er i cytoplasmaet ved interaksjon med ribonuklease DICER , som også initierer dannelsen av det RNA-induserte silencing-komplekset (RISC ). [ 20 ] Dette komplekset er ansvarlig for den observerte gendempingen på grunn av mikro-RNA-ekspresjon og siRNA- mediert RNA - interferens . Veien varierer litt i planter, på grunn av mangelen på DROSHA- homologer ; i stedet er det bare DICER-motparter som utfører noen av behandlingstrinnene. [ 21 ] Veien er også forskjellig for mikro-RNA avledet fra stamløkker fra introniske sekvenser ; i dette tilfellet behandles de av DICER, men ikke av DROSHA. [ 22 ] Både sense- og antisense -trådene til DNA kan fungere som en mal for å produsere mikro-RNA. [ 23 ]
DROSHA [ 24 ] (ARNSEN hos mennesker) [ 25 ] er et kjerneprotein med størrelse mellom 130 og 160 kDa (kilo Dalton ). Inneholder følgende domener:
DROSHA fungerer i et kompleks (mikroprosessor), i forbindelse med et RNA-bindende protein (kalt PASHA i Drosophila eller DGCR8 i pattedyr). DGCR8 [ 26 ] [ 27 ] er et DNA-bindende protein som gjenkjenner dsRNA–ssRNA (dobbeltrådet-enkeltrådet RNA) bindingssetet og posisjonerer ribonukleasen DROSHA i en avstand på 11 nukleotider (tilsvarer en tur på helix) fra leddområdet. Dermed er rollen til DGCR8 i mikroprosessorkomplekset analog med PAZ-domenet til DICER; DGCR8 gir substratspesifisitet og posisjonerer DROSHA- ribonukleasekjernen på riktig måte. Når det gjelder DROSHA-DGCR8, er spesifisitetsdomenet imidlertid lokalisert på en separat polypeptidkjede fra RNase III -domenene . Det har blitt foreslått at det prolinbindende WW- domenet til DGCR8 samhandler med den prolinrike N-terminalen til DROSHA. Det er mulig at DROSHA har andre mulige assosierte proteiner som har WW-domener som gir alternative RNA-substratspesifisiteter og ytterligere biologiske funksjoner til DROSHA.
Effektiv prosessering av pre-mikro-RNA av DROSHA krever tilstedeværelse av lange enkelttrådede RNA-haler ved både 3'- og 5'-enden av hårnålsmolekylet. [ 28 ] Disse enkelttrådede RNA ( ssRNA ) motivene kan variere i sammensetning, mens lengden er av stor betydning for at prosessering skal finne sted. En bioinformatisk analyse av pri-mikro-RNA hos mennesker og fluer identifiserte lignende strukturelle regioner, kalt 'basale segmenter', 'nedre stilker', 'øvre stilker' og 'terminalløkker'. terminalløkker)'; Basert på disse konserverte strukturene er termodynamiske profiler av pri-mikro-RNA-ene blitt bestemt. [ 29 ] DROSHA-komplekset (mikroprosessor) kutter RNA-molekylet ~2 omdreininger fra den terminale sløyfen og ~1 omdreining fra basalsegmentene. I de fleste av de analyserte molekylene inneholder denne regionen uparrede nukleotider og den frie energien til dupleksen er relativt høy sammenlignet med de øvre og nedre stammeregionene [ sitat nødvendig ] . De fleste pre-mikro-RNA-er har ikke en perfekt dobbelttrådet RNA (dsRNA) struktur med en endelig terminal sløyfe. Det er noen mulige forklaringer på denne selektiviteten. En kan være at dsRNA lengre enn 21 basepar aktiverer interferonresponsen og cellens antivirale maskineri. En annen plausibel forklaring kan være at den termodynamiske profilen til pre-mikro-RNA bestemmer hvilken tråd som skal inkorporeres i DICER-komplekset. Det er faktisk påvist klare likheter mellom pri-mikro-RNA-er kodet på enten 5'- eller 3'-tråder. [ 29 ]
Når pre-mikro-RNA er generert, kutter DICER stammen -løkken og to korte komplementære molekyler dannes, men bare ett er integrert i RISC -komplekset (antisensen), som skjer med siRNA- er . Denne strengen er kjent som "guidestrengen" , som velges av proteinet Argonaute, den katalytisk aktive RNase i RISC-komplekset, basert på stabiliteten til 5'-enden. [ 30 ] Den andre (sanse-) strengen, kjent som anti-guide- eller passasjerstrengen , degraderes av RISC-komplekset. [ 31 ] Etter integrering i det nå aktiverte RISC-komplekset (se merknader om RISC-komplekset i siRNA- er), parer mikroRNA-er i henhold til deres basesekvens med det komplementære mRNA-molekylet, og i dyr, i motsetning til siRNA, induserer de i de fleste tilfeller hemming av oversettelsen av nevnte mRNA.
Til tross for at DICER er et grunnleggende enzym i behandlingen av mikro-RNA, er det identifisert en DICER-uavhengig mikro-RNA biogenesevei som bruker den katalytiske spaltningsaktiviteten til Argonaut2 (Ago2). I motsetning til andre mikro-RNA-er, er nivåene av enkelte mikro-RNA-er (miR-451-5', miR-2190-5', miR-2190-3' og miR-735-5') således ikke endret. DICER-mutanter med tap av funksjon, men redusert i MZago2 ( zygotic maternal ) mutanter. Når det gjelder miR-451 (et mikro-RNA implisert i erytroid-avstamningsdifferensiering [ 32 ] ), krever prosessering av pre-miR-451 den katalytiske aktiviteten til Ago2 in vivo . MZago2-mutanter viser forsinket erytropoese som kan reddes ved bruk av villtype Ago2 eller med miR-451-duplekser, men ikke med katalytisk inaktiv Ago2. Derfor har det blitt antydet at Ago2 er i stand til å generere funksjonelle mikro-RNA uavhengig av Dicer. [ 33 ] Lignende resultater er observert i forskjellige organismer. [ 34 ]
Som angitt i tilfellet med siRNA-er, er det fortsatt uklart hvordan det aktiverte RISC-komplekset lokaliserer komplementære mRNA-er i celler. Argonaute-proteiner, de katalytiske komponentene til RISC, er lokalisert i spesifikke områder av cytoplasmaet kalt P-legemer (P-legemer, eller cytoplasmatiske legemer eller GW-legemer, fordi de inneholder GW182-proteinet), som er regioner med høy nedbrytningshastighet av mRNA; [ 35 ] Mikro-RNA-aktivitet er også påvist i P-kropper . [ 36 ] Endring av P-legemer reduserer effektiviteten av RNAi-prosessering, noe som tyder på at P-legemer kan være et kritisk sted for RNAi-prosessering. [ 37 ] Påfølgende studier har imidlertid vist at P-legemer ikke er essensielle for RNAi-prosessering, da celler uten P-legemer kan dempe både siRNA og mikro-RNA. [ 38 ]
Til tross for den betydelige fremgangen som er gjort med å forstå mikroRNA-biogenese og funksjon, forblir mekanismene som brukes av mikroRNA for å regulere genuttrykk under intens debatt. [ 39 ] Faktisk er det publiserte arbeider som indikerer at mikro-RNA i dyreceller undertrykker genuttrykk på fire forskjellige måter:
Videre kan mikro-RNA hos dyr indusere betydelig nedbrytning av mål-mRNA (som plantemikro-RNA), til tross for ufullkommen mRNA-mikro-RNA-paring. Imidlertid er nedbrytningsmekanismen vanligvis annerledes: mikro-RNA induserer nedbrytningen av mål-mRNA ved å fjerne hetten (i 5'-enden) og polyadeninhalen (poly-A, i 3'-enden). '). [ 40 ] Til slutt kunne miRNA-er også dempe mRNA-målene deres ved å sekvestrere dem på diskrete cytoplasmatiske loki (steder), mRNA-prosesseringslegemer eller P-legemer , som mangler translasjonsmaskineri. Til tross for de eksisterende avvikene mellom de forskjellige mekanismene som er foreslått, er de eksperimentelle støttene for hver mekanisme varierte, og er for tiden gjenstand for intense studier for å prøve å belyse dem. Det har blitt antydet at forskjellene som er observert skyldes mangler i forsøkene som er utført, i noen tilfeller forårsaket av bruk av feilaktige modeller i oversettelsesreguleringsstudier. [ 41 ]
Endelig har nyere studier funnet at under visse forhold kan mikro-RNA også aktivere proteinsyntese . [ 42 ]
Generelle kjennetegn ved mikro-RNA: [ 39 ]
Mikro-RNA kan fungere som tumorundertrykkere eller som onkogener ; dens spesifikke innflytelse på hver type kreft gjenstår å bli demonstrert . [ 51 ] Faktisk viste en studie at omtrent 50 % av kommenterte mikroRNA hos mennesker er lokalisert i områder av genomet kjent som skjøre steder , [ 52 ] som er assosiert med utvikling av kreft.
Uttrykket av visse mikro-RNA er korrelert med ulike typer kreft, så de vil fungere som onkogener . For eksempel koblet en rapport fra Sonoki og kolleger [ 53 ] mir -125b-1- genet til leukemi , og beskrev en pasient med forløper B-celle akutt lymfoblastisk leukemi som bar en pre-mikro-RNA-innsetting ved locus av immunoglobulin . tung kjede . Selv om forskerne ikke var i stand til å bestemme hvordan mir-125b-1-ekspresjonen ble modulert i tumorceller, støtter denne studien en rolle for dette genet som et onkomir .
Den første indikasjonen på at mikroRNA kan fungere som tumordempere kom fra en rapport fra Calin og kolleger [ 54 ] som viser at pasienter diagnostisert med en vanlig form for voksen leukemi ( B-celle kronisk lymfoid leukemi eller CLL ), ofte har slettinger eller nedregulering av to mikro-RNA-gener tilstede i en klynge , mir-15a og mir-16-1 . Slettinger innenfor 13q14- lokuset forekommer i mer enn 65 % av KLL-tilfellene, og i mer enn 50 % av mantelcellelymfomer, 16–40 % av multiple myelomer og 60 % av prostatakreft . Således ble et tumorsuppressorgen spådd å ligge i denne 30 kb-regionen. Det er interessant å merke seg at mir-15a og mir-16-1 kartlegges i intronet til et protein ncRNA ( ikke-kodende RNA) gen med ukjent funksjon kalt LEU2. På den annen side etablerer noen studier en sammenheng mellom reduksjonen i uttrykket av let-7 (som regulerer celleproliferasjon og differensiering i C. elegans ) og økningen i tumorigenese og den alvorlige prognosen til berørte pasienter. [ 55 ] I tillegg, under normal utvikling, kan LIN28 (en pluripotenspromoter) forhindre akkumulering av let-7. I følge disse resultatene har det blitt foreslått at let-7 regulerer stamness av celler, undertrykker selvfornyelse og fremmer differensiering, både under normal utvikling og ved kreft.
På den annen side har mikro-RNA også blitt observert å bidra til ondartet progresjon av kreft , spesielt ved å mediere tumorinvasjon og metastasedannelse . [ 56 ]
For eksempel, i C. elegans , tillater mikroRNA rask passasje gjennom de forskjellige utviklingsfasene : [ 57 ] mikroRNA lin-4 [ 58 ] og let-7 [ 59 ] kontrollerer øyeblikket hvor skjebnen til nevronale og hypodermiske celler under larven utvikling er definert. [ 60 ] lin-4, let-7 og andre mikro-RNA gener er bevart i pattedyr, og deres potensielle rolle i pattedyrs embryonale utvikling er under aktiv studie. Hos C. elegans er ekspresjonsnivåene av LIN-14 [ 61 ] og LIN-28 [ 62 ] redusert på grunn av ekspresjonen av lin-4 RNA ved slutten av det første larvestadiet, for å tillate progresjon til larvestadier. . I sene larvestadier kunne ekspresjonen av LIN-41 [ 63 ] og andre gener reduseres ved let-7 RNA-ekspresjon, og frigjøre undertrykkelsen av LIN-29-proteinekspresjonen [ 64 ] og tillate progresjon til voksenstadiet. Siden lin-29 mRNA ikke har steder som er komplementære til let-7 RNA, er lin-29 sannsynligvis ikke et direkte mål for let-7.
På den annen side, i pattedyrmyocytter , induserer aktivering av transkripsjonsfaktoren SRF [ 65 ] ekspresjonen av miR-1–1 [ 66 ] og miR-1–2, [ 67 ] som igjen undertrykker uttrykket av ekspresjon av transkripsjonsfaktor Hand2 [ 68 ] og Notch - liganden , [ 69 ] Delta, og derved påvirke progenitorcelleekspansjon eller differensiering. [ 70 ] SRF induserer også ekspresjonen av miR-133a-1 [ 71 ] og miR-133a-2, [ 72 ] som igjen hemmer SRF i en tilbakemeldingssløyfe . En lignende bane opererer i muskel, bortsett fra at feedback-hemming av Mef2 [ 73 ] og MyoD [ 74 ] oppstår når HDAC4- ekspresjon [ 75 ] reduseres på grunn av demping som utøves av miR-1–1 og miR-1–2.
En av de første påviste mikro-RNAene med en rolle i utviklingen av immunsystemet [ 50 ] var miR-181a; [ 76 ] Dette mikroRNA uttrykkes ved høye nivåer i thymusceller og ved lavere nivåer i celler i hjertet, lymfeknuter og benmarg. I benmargen uttrykkes miR-181a i høyere nivåer av B220+ B-celler enn av CD3 + T-celler . Spesifikt avtar miR-181a-uttrykk på benmargsavledede B-celler under B-cellemodning fra pro-B-cellestadiet av utvikling til pre-B-cellestadiet. I tillegg resulterte ektopisk ekspresjon av miR-181a i celler anriket for hematopoietiske stam- og stamceller i en økning i prosentandelen av CD19+ B-celler og en reduksjon i prosentandelen av CD8+ T-celler i kortsiktige benmargsrekonstitusjonsanalyser. , som viser at cellelinjespesifisiteten til mikro-RNA kan ha en rolle i reguleringen av lymfocyttutvikling.
På den annen side har en romlig fordeling av mikro-RNA også blitt oppdaget: i sebrafiskembryoer indikerer lokaliseringsmønstrene til individuelle mikro- RNAer at deres aktivitet kan begrenses til vev og organer de forekommer i. de uttrykker seg selv. For eksempel uttrykkes miR-206 [ 77 ] primært i muskler, miR-126 [ 78 ] i blodårer og hjerte, miR-200a [ 79 ] i sidelinjesystemet (et systemmekanosensorisk som registrerer vannbevegelse) og sanseorganer , og miR-30c [ 80 ] i forløperen til nyrene. [ 81 ]
To uavhengige studier i 2007 på mus [ 82 ] [ 83 ] indikerer at en betydelig mengde mors mikro-RNA er arvet av zygotene, og at disse mors mikro-RNA kan ha en viktig rolle i de tidlige stadiene av embryonal utvikling. ( mors effekt ).
Genomomfattende assosiasjonsstudier ( "GWAS" ) har blitt brukt for å identifisere visse mikroRNAer som ved å modulere mRNA-translasjon fungerer som avgjørende regulatorer av kolesterol, triglyserider og energihomeostase i kroppen.
Mikro-RNA-ene involvert i metabolsk kontroll og assosiert med kardiometabolske lidelser er: miR-128-1, miR-148a, miR-130b og miR-301b. De to første er de mest relevante i denne handlingen, siden introduksjonen av forløpere til disse mikro-RNA-ene i humane leverceller utløste et lavere uttrykk av genet for LDL-reseptoren og ABCA1 ( ATP-bindende kassett A1 ). Tvert imot, med introduksjonen av anti-mikro-RNA av disse, økte uttrykket av LDL-reseptoren og ABCA1.
LDL-reseptoren fanger LDL-kolesterol, derfor har den en rolle i hepatisk clearance og i forebygging av aterosklerose og hjerte- og karsykdommer. Og disse mikro-RNA-ene påvirker uttrykket, reduserer det.
ABCA1 er en kritisk komponent i den totale kolesterolveien, da den letter de novo produksjonen av HDL i leveren og tarmen, som er ansvarlig for å fjerne kolesterol fra perifere celler og transportere det til leveren for utskillelse. disse mikro-RNA-ene påvirker deres uttrykk, og derfor utgangen av kolesterol fra cellene som skal skilles ut. tvert imot, anti-mikro-RNA av disse favoriserer uttrykket av ABCA1, og produserer større mengder HDL.
Overekspresjon av miR-128-1 og miR-148a reduserer hovedsakelig hepatiske nivåer av ABCA1 og LDL-R. MiR 128-1 endrer også uttrykket av IRS1 (insulinreseptor) som bidrar til insulinresistens, og mikro-RNA-148a endrer uttrykket av CPT1A. Kolesterol og sirkulerende lipidprofiler hos mus som overuttrykker disse mikroRNA-ene avslørte en markant reduksjon i plasma HDL-C-nivåer sammenlignet med kontroller. Fordi ABCA1 er nødvendig for syntesen, og dette har avtatt med introduksjonen av mikro-RNA. Alt dette reverseres ved å introdusere anti-mikro-RNA, derfor kan disse brukes i behandlingen av sykdommer relatert til homeostase, glukosefølsomhet, insulinsignalering, triglyserider og blodkolesterol.