Proteasomet eller proteasomet er et stort proteinkompleks som finnes i alle eukaryote og arkeale celler , så vel som i noen bakterier , som er ansvarlig for å utføre nedbrytningen av unødvendige eller skadede proteiner (kalt proteolyse ). I eukaryote celler finnes proteasomer vanligvis i cytoplasmaet . [ 1 ] Proteasomer representerer en viktig mekanisme der celler kontrollerer konsentrasjonen av visse proteiner gjennom deres nedbrytning. [ 2 ] Når proteiner brytes ned, er de merket med et lite protein kalt ubiquitin . Når ett av disse ubiquitinmolekylene har blitt bundet til et protein som skal elimineres, ved hjelp av enzymet ubiquitinligase , begynner flere ubiquitinproteiner å bli tilsatt, noe som resulterer i dannelsen av en polyubiquitinkjede som lar proteasomet identifisere og bryte ned protein. [ 2 ]
Strukturelt sett er et proteasom et tønneformet kompleks som inneholder en "kjerne" sammensatt av fire ringer stablet rundt en sentral pore. Hver av disse ringene består av syv individuelle proteiner. De to indre ringene inneholder β-proteinunderenheter, som utgjør de aktive stedene til proteaser . Disse stedene finnes på de indre overflatene av ringene, slik at proteinet som skal degraderes må inn gjennom poren før det behandles. De to ytre ringene inneholder α-underenheter, hvis funksjon er å opprettholde en "port" som proteiner kan komme inn gjennom tønnen. α-underenhetene kontrolleres av regulatoriske regioner, noen ganger kalt "tabs", som gjenkjenner polyubiquitinforbindelser på proteinsubstrater og starter nedbrytningsprosessen. Ubiquitineringsprosessen pluss den proteosomale nedbrytningsprosessen kalles det ubiquitin-proteosomale systemet.
Proteosomnedbrytning er en viktig mekanisme i flere cellulære prosesser, inkludert cellesyklusen , regulering av genuttrykk og respons på oksidativt stress . Betydningen av proteinnedbrytning i celler og rollen til ubiquitin i denne prosessen ble anerkjent med Nobelprisen i kjemi i 2004 , tildelt Aarón Ciechanover , Avram Hershko og Irwin Rose . [ 3 ]
Før oppdagelsen av ubiquitin-proteasomsystemet, ble proteinnedbrytning antatt å finne sted primært i lysosomer , organeller hvis indre er surt og rikt på proteaser som kan bryte ned og resirkulere eksogene proteiner og andre skadede organeller. [ 2 ] Et arbeid av Alfred Goldberg i 1977 som studerte nedbrytningen av et ATP- avhengig protein i retikulocytter , som mangler lysosomer, antydet imidlertid eksistensen av et andre intracellulært nedbrytningssystem. [ 4 ] I 1978 ble det vist at dette systemet hadde flere forskjellige proteinkjeder, noe helt nytt når det gjelder proteaser. [ 5 ] Ytterligere arbeid med histonmodifikasjon førte til uventet identifisering av en kovalent modifikasjon tilstede i histoner, som besto av en forgrenet kobling av en lysinrest av histonen med glycinresten ved C-terminalen av histonen. ubiquitin, av ukjent funksjon. [ 6 ] Det var da at proteinet som allerede er identifisert som ATP-avhengig proteinfaktor 1 (APPF 1), involvert i proteinnedbrytning, ble oppdaget å være ubiquitin. [ 7 ] Det ATP-avhengige proteolytiske komplekset som var ansvarlig for ubiquitin-avhengig proteinnedbrytning ble senere oppdaget og kalt 26S-proteasomet. [ 8 ] [ 9 ]
Det meste av arbeidet som førte til oppdagelsen av det allestedsnærværende proteasomsystemet fant sted på slutten av 1970-tallet og begynnelsen av 1980- tallet ved Israel Institute of Technology , nærmere bestemt i laboratoriet til Avram Hershko , der Aaron Ciechanover jobbet som hovedfagsstudent. Hershko tilbrakte et sabbatsår i Irwin Roses laboratorium , ved Fox Chase Cancer Center i Philadelphia , USA , og unnfanget hovedideene til teorien. Roses rolle i oppdagelsen var også avgjørende. [ 10 ] De tre forskerne delte 2004 Nobelprisen i kjemi for oppdagelsen av dette systemet. [ 3 ]
Selv om elektronmikroskopi avslørte de stablede ringene til proteasomet på midten av 1980-tallet, [ 11 ] ble den første strukturen til proteasomkjernen ikke løst før i 1994 ved røntgenkrystallografi . [ 12 ] Og det var ikke før i 2006 at den første strukturen til kjernen ble løst ved å danne et kompleks med de regulatoriske regionene.
Underenhetene til proteasomer blir vanligvis referert til med deres Svedberg-sedimentasjonskoeffisient ( S). Den vanligste formen for proteasom kalt 26S, som er omtrent 2000 kilodalton (kDa) i molekylmasse , har en 20S kjerne og to 19S regulatoriske underenheter. Kjernen, som er hul, har et lukket hulrom hvor proteiner brytes ned. Åpninger i endene av kjernen tjener som innganger for proteiner. De regulatoriske underenhetene i 19S plassert i endene av fatet har flere steder med ATPase- aktivitet og ubiquitin-bindingsseter, og danner dermed strukturen som er ansvarlig for både å gjenkjenne polyubiquitinerte proteiner og overføre dem til den katalytiske kjernen. Det finnes også en alternativ 11S regulatorisk underenhet, som i utgangspunktet fungerer på samme måte som 19S underenhetene. 11S-underenhetene antas å spille en nøkkelrolle i nedbrytningen av eksogene peptider produsert etter virusinfeksjon . [ 13 ]
Antallet og mangfoldet av 20S-kjerneunderenhetene avhenger av organismen. Spesialiserte underenheter er større i antall i flercellede enn i encellede organismer , og er større i eukaryote enn i prokaryote celler . Alle 20S-kjernene består av 4 stablede heptagonale ringer , sammensatt av to forskjellige typer underenheter; α-underenheter, av strukturell natur og β-underenheter, generelt av katalytisk natur . De to ytre ringene er sammensatt av α-underenheter, som tjener som ankre for de regulatoriske partiklene og fungerer som en port som forhindrer vilkårlig inntreden av proteiner i det indre hulrommet. De to indre ringene, sammensatt av β-underenheter, rommer de aktive stedene til proteasene som utfører de katalytiske reaksjonene. Størrelsen på protesomer er relativt bevart og er vanligvis 150 ångstrøm (Å) til 115Å. Det indre kammeret er maksimalt 53Å bredt, selv om inngangen kan være nesten 13Å, noe som tyder på at proteinsubstrater må foldes ut for å komme inn.
Archaea-organismer har alle identiske α- og β-proteasomunderenheter, mens eukaryote proteasomer har 7 forskjellige typer underenheter. Hos pattedyr er β1, β2 og β5 underenhetene katalytiske, og selv om de presenterer en felles mekanisme, presenterer de 3 forskjellige typer spesifikke substrater, en basert på chymotrypsin , en annen basert på trypsin og den andre basert på PHGH .
Andre former for β-underenheter finnes i β1i, β2i og β5i, og kan uttrykkes i hematopoietiske celler , som respons på eksponering for pro - inflammatoriske signaler , som cytokiner , spesielt gamma-interferon . Proteasomene som presenterer disse spesielle underenhetene er kjent som immunoproteasomer.
Hos eukaryoter består de regulatoriske 19S-partiklene, eller fanene, av 19 individuelle proteiner og kan deles inn i to grupper; en 10-protein "base", som binder seg direkte til den ytre a-ringen av 20S-kjernen, og en 9-protein "cap", hvor polyubiquitin-komplekset binder.
Av de 10 baseproteinene har 6 aktive ATPase-steder. Assosiasjonen mellom 20S-kjernen og 19S-regulatorpartiklene med hverandre krever binding av ATP til de aktive ATP-bindingsstedene på 19S-partiklene. ATP-hydrolyse er nødvendig for at hele komplekset skal bryte ned et foldet og ubiquitinisert protein . Likevel er det ikke klart om energien fra hydrolyse brukes til å spalte substratet, eller for å tillate inntreden i kjernen, eller begge deler. Fra 2006 er strukturen til 26S-proteasomer ennå ikke løst, men det antas at både 19S- og 11S-regulerende partikler binder seg på lignende måte som 20S-kjerne-a-ringen.
Noen individuelle komponenter av 19S-partikler spiller også en rolle i andre reguleringssystemer. For eksempel er Gankyrin et nyoppdaget onkogent protein, som er en del av den regulatoriske partikkelen 19S, som binder seg til den syklinavhengige kinasen CDK4 , og spiller også en viktig rolle i gjenkjennelsen av det ubiquitiniserte proteinet P53 , takket være dets affinitet. til ubiquitin -ligasen MDM2 . Dette proteinet er anti - apoptotisk og dets overskudd er påvist i noen tumorceller som hepatocellulært karsinom .
20S-kjernene kan også være assosiert med en andre type regulatoriske partikler, kalt 11S, med en heptagonal struktur som ikke inneholder aktive ATPase-steder, som bare er i stand til å fremme nedbrytningen av små peptider og ikke hele proteiner. Det antas at denne manglende evnen er avledet fra umuligheten av å utfolde større underlag. Strukturen som nettopp er nevnt er kjent under navnet PA28 eller REG. Mekanismene som den binder seg til den sentrale kjernen gjennom C-terminalene til proteinunderenhetene, som induserer endringer i konformasjonen til α-ringene for å åpne 20S-partiklene, ser ut til å være lik de til 19S-partiklene. Ekspresjonen av 11S-partikler induseres av gamma-interferon og er ansvarlig, sammen med β-subenhetene til immunoproteasomet, for generering av peptider som binder seg til hovedhistokompatibilitetskomplekset .
Sammenstillingen av proteasomet er en kompleks prosess på grunn av antall underenheter som må gå sammen for å danne det aktive komplekset. β-underenhetene syntetiseres med en "pro-peptid" N-terminal som er post-translasjonelt modifisert under sammenstilling av 20S-partiklene for ikke å eksponere det aktive stedet. 20S-partikler er satt sammen med to halvdeler, som hver består av 7 pro β-deler festet til en 7-delt α-ring. Assosiasjon av β-ringene til de 2 proteasomdelene utløser treoninavhengig autolyse av propeptider for å eksponere det aktive stedet. disse interaksjonene mellom β-partikler medieres av ioniske og hydrofobe bindinger der alfa-heliksene er bevart , som, hvis de blir ødelagt av mutasjoner , vil skade proteasomets evne til å sette seg sammen. Foreningen av de to halvdelene begynner med dannelsen av α-underenhetene i form av en heptagonal ring, og danner rammeverket for assosiasjonen av de tilsvarende β-ringene. Lite er kjent om dannelsen av α-ringer.
Generelt er lite kjent om montering og modning av 19S regulatoriske partikler. De antas å være satt sammen i to distinkte underkomponenter, den ATPase-holdige basen og den ubiquitiniserte proteinidentifiserende hetten. De 6 ATPasene i basen må settes sammen i par ved vekselvirkninger med spiralspole . Rekkefølgen som de 19 komponentene til den regulatoriske partikkelen settes sammen i, er sannsynligvis en mekanisme som forhindrer eksponering av aktive steder inntil sammenstillingen er fullført.
20S-proteasomet er både allestedsnærværende og essensielt i eukaryoter . Noen prokaryoter , inkludert noen bakterier av ordenen actinomycetales , har homologer av 20S-proteasomet, mens de fleste bakterier har hsIV- og hsIU- genene , hvis genprodukter er en "ring"-protease og ATPase. hsIV-proteinet anses å være stamfaren til 20S-proteasomet. hsIV er generelt ikke-essensielt i bakterier, og ikke alle bakterier har det. Noen protister har både 20S proteasomsystemet og hsIV.
Sekvensanalyse ¡'¡' antyder at de katalytiske β-underenhetene divergerte evolusjonært før de strukturelt dominerende α-underenhetene. I bakterier med 20S-proteasomer har β-underenhetene en større sekvensiell sammenfall med hensyn til β-underenhetene til archaea og eukaryoter, mens α-subenhetene har lavere sammenfall. Tilstedeværelsen av 20S-proteasomer i bakterier kan tilskrives horisontale genetiske overføringer ¡'¡' mens diversifiseringen mellom eukaryote underenheter tilskrives flere hendelser med genduplisering ¡'¡'.
Cellesyklusprogresjon kontrolleres av den ordnede virkningen av cyklinavhengige kinaser (CDK) aktivert av spesifikke cykliner som avgrenser fasene i cellesyklusen . Mitotiske sykliner som vedvarer i cellen i noen minutter har en av de korteste levetidene av alle intracellulære proteiner. Når CDK + cyklinkomplekset har utført sin funksjon, blir det assosierte syklinet polyubiquitinert og degradert av proteasomet, noe som gir kontinuitet til cellesyklusen. Spesielt krever utgang fra mitose proteasomavhengig dissosiasjon av den cyclin B -regulatoriske komponenten i det mitosefremmende faktorkomplekset . I virveldyrceller ¡'¡'.
Tidlige sjekkpunkter som ¡'¡' mellom G1 og S-fasen involverer på samme måte proteasomnedbrytning av cyclin A, hvis ubiquitinisering fremmes av det anafasefremmende komplekset (APC), en E3 ubiquitinligase. APC og proteinkomplekset (SCF-komplekset) er 2 regulatorer av cyclin-nedbrytning og sjekkpunkter. SCF reguleres av APC ved ubiquitinisering av ¡'¡'-komponenten, som forhindrer SCF-aktivitet før overgangen fra G1- til S-fasen.
Hos planter induserer bruken av auxiner eller fytohormoner , som styrer vekstretningen og tropismen , markeringen for proteasomnedbrytning av en klasse undertrykkende transkripsjonsfaktorer kjent som Aux/IAA-proteiner. Disse proteinene er ubiquitinisert av SCFTIR1 eller SCF i kompleks med auxinreseptoren TIR1. Nedbrytning av Aux/IAA-proteiner frigjør transkripsjonsfaktorer i auxin-responsfaktor-familien (ARF) ¡'¡' og induserer ekspresjonen av ARF-relaterte gener. De cellulære konsekvensene av ARF-aktivering avhenger av plantetypen og dens utviklingsstadium, men generelt styrer de veksten av røtter og bladårer ¡'¡'. Spesifisiteten til ARF-frigjøringsresponsen antas å være mediert av spesifisiteten til responsen i paringen av individuelle ARF- og Aux/IAA-proteiner.
Både interne og eksterne signaler kan indusere apoptose eller programmert celledød. Den påfølgende dekonstruksjonen av cellulære komponenter utføres hovedsakelig av spesifikke proteaser kalt caspaser , men proteasomet spiller også flere viktige roller i apoptotiske prosesser. Under apoptose har proteasomer nær kjernen blitt observert som translokerer membranblebber, karakteristisk for apoptose, til utsiden.
Proteosomhemming har forskjellige effekter på apoptotisk induksjon av forskjellige celletyper. Proteasomet er vanligvis ikke nødvendig for apoptose, selv om dets hemming er proapoptotisk i de fleste celletyper som har blitt studert. Imidlertid induserer noen cellearter - spesielt primærvev av differensierte og stasjonære-faseceller som T -celler og nevroner - ikke apoptose ved eksponering for proteasomhemmere. Mekanismen for denne effekten er ikke helt klar, men den antas å være cellespesifikk ved steady states eller et resultat av en annen aktivitet av den proapoptotiske JNK -kinasen . Evnen til proteasomhemmere til å indusere apoptose i raskt delende celler har nylig blitt utnyttet i utviklingen av kjemoterapeutiske midler .
Som svar på situasjoner med cellulært stress , som infeksjoner , plutselige endringer i temperatur eller oksidativ skade , uttrykkes varmesjokkproteiner , som identifiserer feilfoldede eller utfoldede proteiner og markerer dem for proteasomnedbrytning. Både Hsp27 og Hsp90 - chaperone proteiner er involvert i å øke aktiviteten til det proteosomale ubiquitino-systemet, selv om de ikke er direkte deltakere i prosessen. På den annen side er Hsp70 -proteinet ¡'¡' på overflaten av feilfoldede proteiner og bruker E3 ubiquitin-ligaser som CHIP for å merke proteiner for proteasomnedbrytning. CHIP-proteinet (karboksylterminalen til Hsp70-interagerende protein) reguleres ved å hemme interaksjoner mellom enzymet E3 CHIP og dets partner ¡'¡' E2.
Lignende mekanismer eksisterer for å fremme nedbrytningen av svært oksidativt skadede proteiner av proteasomsystemet. Spesielt er proteasomer lokalisert nær kjernen regulert av PARP og, når de aktiveres, bryter de ofte ned upassende oksiderte histoner . Oksiderte proteiner danner ofte gigantiske amorfe aggregater i cellen, kan brytes ned direkte av 20S-kjernen uten regulering av 19S-partikkelen, og krever ikke ATP-hydrolysering eller ubiquitinisering, men høye nivåer av oksidativ skade øker graden av kryssing ¡' ¡' mellom proteinfragmenter, ¡'¡' motstandsdyktig mot proteolyse. Store mengder og størrelser av disse sterkt oksiderte aggregatene er relatert til aldring .
Nedsatt proteasomaktivitet har blitt foreslått som en forklaring på noen av de nevrodegenerative sykdommene i høy alder som deler den karakteristiske tilstedeværelsen av feilfoldede proteiner, slik som Parkinsons sykdom eller Alzheimers sykdom . I disse sykdommene kan store uløselige aggregater av feilfoldede proteiner dannes og forårsake nevrotoksisitet , gjennom mekanismer som ennå ikke er godt forstått. Redusert proteasomaktivitet har blitt foreslått som en av årsakene til Lewi - kroppaggregering og dannelse ved Parkinsons sykdom. Denne hypotesen støttes av observasjonen at gjærmodeller av Parkinsons er mer mottakelige for toksisiteten til α-synuklein , hovedproteinkomponenten i lewy-legemer, under forhold med lav proteasomaktivitet.
Proteasomer spiller en sekundær, men kritisk rolle i funksjonen til det adaptive immunsystemet . Antigene peptider presenteres av store histokompatibilitetsklasse I ( MHC I ) systemproteiner på overflaten av alle kjerneholdige celler i kroppen. Disse peptidene er produkter av proteasomal nedbrytning av proteiner som stammer fra det invaderende patogenet. Selv om vanlige proteasomer kan delta i denne prosessen, er et spesialisert kompleks sammensatt av proteiner, hvis uttrykk induseres av interferon gamma og tumornekrosefaktor alfa, ansvarlig for å produsere peptider med optimal sammensetning og størrelse for MHC I-binding. Blant proteinene som øker deres uttrykk i møte med immunresponsen, er den regulatoriske 11S-partikkelen, hvis viktigste kjente biologiske funksjon er reguleringen av produksjonen av MHC-ligander, og de spesialiserte β-underenhetene kalt β1i, β2i og β5i med lignende affiniteter spesifikt substrat. Komplekset som dannes med de spesialiserte β-underenhetene kalles et immunproteasom .
Styrken til MHC klasse I- bindingen og dens ligand avhenger av sammensetningen av den C-terminale enden av liganden, peptidene er bundet av hydrogenbindinger og ved nærkontakt med den såkalte "B-lomme"-regionen på MHC-overflaten. I. Flere alleler av MHC klasse I har høyere affinitet for de hydrofobe C-terminale restene av peptider; immunoproteasomet har en tendens til å generere peptider med hydrofobe C-terminale ender.
På grunn av sin rolle i genereringen av den aktiverte formen av NF-kB , en antiapoptotisk og pro-inflammatorisk regulator av cytokinekspresjon , har proteasomal aktivitet vært relatert til autoimmune og inflammatoriske sykdommer. Høye nivåer av proteasomaktivitet er korrelert med tilstedeværelsen av sykdom og har vært implisert i autoimmune sykdommer som lupus erythematosus og revmatoid artritt .
Proteosomhemmere har effektiv antitumoraktivitet i cellekulturer , og induserer apoptose ved å forstyrre den regulatoriske nedbrytningen av nøkkelproteiner for cellesyklusen. Denne tilnærmingen til indusert seleksjon av apoptose i tumorceller har vist seg effektiv i dyremodeller og menneskelige forsøk. Bortezomib , et molekyl utviklet av millenium pharmaceuticals og kjent kommersielt som velcade, er den første proteasomhemmeren som nådde klinisk bruk som et kjemoterapeutisk middel . Bortezomib brukes til behandling av multippelt myelom . Multippelt myelom har blitt observert å øke nivået av proteasomer i blodplasmaet , som reduseres med effektiv kjemoterapi. Dyrestudier tyder på at bortezomib kan ha en signifikant klinisk effekt ved behandling av kreft i bukspyttkjertelen . Tidlige prekliniske og kliniske studier har begynt å undersøke effektiviteten av bruk av bortezomib i andre B-celle- assosierte kreftformer , spesielt noen typer non-Hodgkins lymfom .
Ritonavir - molekylet , kommersielt kalt Norvir, ble utviklet som en proteasehemmer for å angripe HIV -infeksjon . Imidlertid har det vist seg å hemme proteasomer så vel som frie proteaser ; spesifikt proteasomaktiviteten til chymotrypsin , mens aktiviteten til trypsin er noe økt. Dyrestudier tyder på at ritonavir kan ha hemmende effekter på gliomcellevekst.
Proteosomhemmere har også vist lovende ved behandling av autoimmune sykdommer i dyrestudier. For eksempel fant studier på mus transplantert med menneskelig hud en reduksjon i størrelsen på psoriasislesjoner etter behandling med en proteasomhemmer. Proteosomhemmere har også vist positive effekter hos gnagere med astma .
Merking og hemming av proteasomet er av interesse i laboratoriet, både for in vivo og in vitro studier av cellulær proteasomaktivitet Den vanligste proteasomhemmeren som brukes i laboratoriet er Lactacystin , et naturprodukt syntetisert av bakterien Streptomyces . Fluorescerende inhibitorer er også utviklet for å kunne spesifikt markere de aktive stedene til det sammensatte proteasomet.