I molekylær genetikk er mikrosatellitter ( SSR eller STR for deres akronymer på engelsk for enkel sekvensrepetisjon og kort tandemrepetisjon ) DNA -sekvenser der et fragment (hvis størrelse varierer fra to til seks basepar) gjentas fortløpende. Variasjonen i antall repetisjoner, og ikke den gjentatte sekvensen, skaper forskjellige alleler .
De finnes vanligvis i ikke-kodende områder av DNA. De er nøytrale, co-dominante og har en høy mutasjonsrate , noe som gjør dem svært polymorfe. De brukes som molekylære markører i en lang rekke bruksområder innen genetikk , for eksempel forhold og populasjonsstudier . Dette skyldes dens evne til å generere et personlig genetisk fingeravtrykk eller genetisk profil.
Det skal bemerkes at for hver av STR-ene som vi kan finne i genomet, etableres frekvenser i antall repetisjoner i populasjonen, det vil si at for hver STR er det et visst område i antall "normale" repetisjoner innenfor populasjonen (for eksempel mellom 10 og 13 repetisjoner for en bestemt STR), mens det er andre antall repetisjoner som settes sjeldnere ved den markøren.
En mikrosatellitt består vanligvis av et repeterende motiv, der den gjentatte sekvensen er inneholdt, og to flankerende regioner, som finnes på hver side av det repeterende motivet. Imidlertid er det tilfeller der det kan være to eller flere gjentagende motiver i en mikrosatellitt. For at en mikrosatellitt skal anses som nyttig som en molekylær markør, må all sekvensvariasjon eller polymorfisme finnes innenfor det repeterende motivet, mens de flankerende områdene må være svært konserverte, til det punktet at de ikke viser noen sekvensvariasjon i det hele tatt.
For å kunne skille mellom to mikrosatellitter som bare er forskjellige i antall repetisjoner, må vi gjøre en PCR . For å gjøre dette designes primere eller initiatorer (også kalt primere), som er små DNA-fragmenter komplementære til de flankerende områdene, og som gjør at mikrosatellitten vår kan amplifiseres (eller produsere et høyt antall kopier).
Fragmentene som produseres på denne måten separeres i henhold til deres lengde i basepar gjennom agarosegelelektroforese . Med utgangspunkt i hypotesen om at i en mikrosatellitt kun antallet repetisjoner innenfor det repeterende motivet varierer, kan vi vite hvor mange repetisjoner vår mikrosatellitt har etter størrelsen på båndet. Når elektroforesen er ferdig, kan vi sammenligne noen mikrosatellitter med andre, så lenge de er alleler av samme repeterende motiv.
Disse allelene vil bli arvet på en co- dominant måte , det vil si at ved hvert locus kan et individ ha en eller flere alleler, avhengig av antall sett med kromosomer den har. For eksempel er mennesker diploide , det vil si at vi har to komplette sett med kromosomer, og derfor kan vi for et locus av en mikrosatellitt presentere ett allel (hvis begge foreldrene overførte alleler av samme sekvens og størrelse) eller to alleler (hvis hver forelder arvet oss et allel av en annen størrelse).
Mikrosatellitter har vist seg å være allsidige molekylære markører, spesielt for populasjonsanalyser, men de er ikke uten begrensninger. Mikrosatellitter utviklet for en bestemt art kan ofte brukes på beslektede arter, men prosentandelen av loci som er vellykket amplifisert kan reduseres med økende genetisk avstand.
Andre begrensninger, mye mer prosaiske, skyldes kontaminering av prøvene, som kan gi opphav til falske profiler, stoffer som hemmer PCR-reaksjonen og som ikke lar oss vite den genetiske profilen til materialet som er funnet, nedbrytningen av DNA, som produseres spontant av forholdene i miljøet og enzymene til andre organismer og som kan gi opphav til delprofiler, forskjellige artefakter som endrer lesingen av resultatene, samt nye alleler som ikke tidligere er karakterisert og som må innlemmes i databaser for å tillate fremtidig gjenkjenning.
Mikrosatellitter er klassifisert i henhold til antall nukleotider som repetisjonsmotivet har som: mono, di, tri, tetra, penta eller heksanukleotid.
Klassifiseringen inkluderer også rekkefølgemønsteret til motivene:
Mange mikrosatellitter finnes i ikke-kodende DNA og er biologisk dempet. Andre finnes i regulatorisk eller til og med kodende DNA - mikrosatellittmutasjoner kan i slike tilfeller føre til fenotypiske endringer og sykdom. Nyere studier gir bevis for at mikrosatellitter kan fungere som forsterkere av sykdomsrelevante regulatoriske gener. [ 1 ] [ 2 ]
Hos pattedyr inneholder 20 % til 40 % av proteinene gjentatte sekvenser av aminosyrer kodet av korte sekvensrepetisjoner. Det meste av den korte repeterende sekvensen i de proteinkodende delene av genomet har en repeterende enhet på tre nukleotider, siden lengden ikke vil forårsake leserammeforskyvning ved mutasjon. [ 3 ] Hver trinukleotid-repetisjonssekvens blir transkribert til en repeterende serie av de samme aminosyrene. I gjær er de vanligste repeterende aminosyrene glutamin, glutaminsyre, asparagin, asparaginsyre og serin.
Mutasjoner i disse repeterende segmentene kan påvirke de fysiske og kjemiske egenskapene til proteiner, med potensial til å produsere gradvise og forutsigbare endringer i proteinvirkning. [ 4 ] For eksempel fører lengdeendringer av tandem-repetisjonsregioner i Runx2-genet til forskjeller i ansiktslengde hos tamhunder ( Canis familiaris ), med en sammenheng mellom lange sekvenslengder og lange ansikter. [ 5 ] Denne assosiasjonen gjelder også for et bredere spekter av kjøttetende arter. Lengdeforandringer i polyalanin-kanaler i HOXA13-genet er knyttet til hånd-hud-genital syndrom, en utviklingsforstyrrelse hos mennesker. [ 6 ] Disse endringene er knyttet til mer enn 40 nevrologiske sykdommer hos mennesker. De evolusjonære endringene av slip-replikasjon forekommer også i de enkleste organismer. For eksempel er endringer i mikrosatellittlengde vanlige i membranoverflateproteiner i gjær, noe som gir raske endringer i celleegenskaper. [ 7 ] Spesifikt styrer endringer i lengde i FLO1-genet nivået av adhesjon til underlag. [ 8 ] Korte repeterende sekvenser gir også rask evolusjonær endring av proteiner i patogene bakterier; dette kan tillate den å holde tritt med immunologiske endringer i vertene. [ 9 ]
Endringer i mikrosatellittlengde innenfor promotorer og andre cis-regulerende regioner kan også endre genuttrykk raskt, mellom generasjoner. Det menneskelige genomet inneholder mange (>16 000) korte repetisjonssekvenser i regulatoriske regioner, som gir små justeringer i uttrykket av mange gener.
Endringer i lengden på bakterielle SSR-er kan påvirke dannelsen av Haemophilus influenzae fimbriae ved å endre promoteren. Minisatellitter er også assosiert med rikelige variasjoner i cis-regulatoriske kontrollregioner i det menneskelige genomet. Og mikrosatellitter i kontrollregioner av vasopressin 1a-reseptorgenet i sopp påvirker deres sosiale oppførsel, og nivået av monogami. [ 10 ]
Mikrosatellitter i introner påvirker også fenotype, gjennom midler som foreløpig ikke er forstått. For eksempel ser det ut til at en GAA-triplettutvidelse i det første intronet til X25-genet forstyrrer transkripsjon, og forårsaker Friedreichs Ataxia . Tandem-repetisjoner i det første intronet av asparaginsyntetase-genet er assosiert med akutt lymfatisk leukemi. [ 11 ] En gjentatt polymorfisme i det fjerde intronet til NOS3-genet er knyttet til hypertensjon i en tunisisk befolkning. Reduserte repetisjonslengder i EGFR-genet er knyttet til osteosarkomer.
En arkaisk form for konservert spleising i sebrafisk er kjent for å bruke mikrosatellittsekvenser i intron-mRNA for intronfjerning i fravær av U2AF2 og annet spleisemaskineri. [ 12 ]
Nesten 50 % av det menneskelige genomet er inneholdt i ulike typer transposerbare elementer (også kalt transposoner, eller "hoppende gener"), hvorav mange inneholder repeterende DNA. [ 13 ] Det er sannsynlig at korte sekvensrepetisjoner på disse stedene også er involvert i reguleringen av genuttrykk. [ 14 ]
Siden mikrosatellitter er mer eller mindre fordelt gjennom genomet til eukaryoter, [ n. 1 ] men med lav frekvens i de kodende regionene og, kanskje også i telomerene , [ n. 1 ] og deres spesielle fordeler når det gjelder polymorfinivå, lave kostnader og kodominans, har bruken av mikrosatellitter hatt stor innvirkning på studiet av genetikken til dyr, planter og mennesker siden de ble oppdaget i 1989. [ 19 ] [ 20 ] Det høye nivået av polymorfisme som det presenterer kan skyldes DNA-polymerase, som, når det forsterker regionene der det er repetisjoner, øker antallet feil, noe som forårsaker en økning eller reduksjon i antall repetisjoner og derfor rekombinasjon av homologe kromosomer, en rekombinasjon kan forekomme, med andre ord skjer det en ulik overkrysning, hvor det ene av kromosomene bærer mer informasjon enn det andre.
I koblingsstudier, ved å studere familier som presenterer en konsentrert sykdom, har monogene eller oligogene sykdommer blitt beskrevet. På denne måten har man lokalisert gener som BRCA1 og BRCA2 (brystkreft 1 og brystkreft 2), eller MSH2 (MutS homolog 2).
Prinsippet for farskapstesting ved bruk av molekylære markører består i å sammenligne genotypen og/eller fenotypen til avkommet med foreldrenes. Som et "mendelsk" prinsipp kommer en av allelene som et individ presenterer fra faren og den andre fra moren. I nevnte analyse, i likhet med den individuelle identifiseringen, må identifiseringen av vitnet/vitnene, både på fenotypisk og genotypisk nivå, være fullstendig kjent og konsistent med informasjonen som er innhentet i analysene utført på individet.
Den høye polymorfismen som SSR-er presenterer og muligheten for å kunne detektere begge allelene gjør dem svært nyttige for individuelle identifikasjoner hos mennesker, siden det er svært usannsynlig at to individer valgt tilfeldig, hvis de analyseres for en serie med markører, deler alle deres egenskaper alleler. Det er ganske mange STR-er som oppfyller de nødvendige egenskapene som skal brukes til å identifisere en person, men bare 16 brukes til å lage et unikt genetisk fingeravtrykk, som kan utvides til 21. Med dette antallet markører er det praktisk talt umulig for to personer å ha samme genetiske profil.
For å velge markørene som skal brukes, bør de oppfylle egenskapene beskrevet ovenfor og også presentere: høy variabilitet, stabil arv (lav mutasjonshastighet), høy reproduserbarhet og presisjon, fravær av "null" alleler, være en enkel, rask prosedyre, økonomisk, potensielt automatisert, at genotypeinformasjonen kan overføres raskt, at kilden til DNA ikke er begrenset bare til ferske blodprøver eller store mengder DNA, og til slutt presenterer den en uavhengig segregering med andre markører når den kombineres i beviset.
Tradisjonelt har farskapstester hovedsakelig blitt utført gjennom blodtyping, inkludert både serologiske tester og blodgrupper (hemotyping); samt elektroforetisk analyse av polymorfismen til proteiner og blodenzymer (allozymer). Disse testene er nå erstattet av bruk av mikrosatellitter.
Kombinasjonen av disse systemene gir en 97 % sannsynlighet for å oppdage eller tildele en riktig far eller mor og nær 100 % sannsynlighet for en krysning mellom individer.
Utviklingen av DNA-analysemetodikk, og spesielt bruken av PCR-teknikken for mikrosatellitttyping, endrer radikalt feltet for individuell identifikasjon, ikke bare hos mennesker, men også hos husdyr. Det er av denne grunn og gitt det store antallet SSR-er som er rapportert for forskjellige arter, at International Society for Animal Genetics (ISAG) og Food and Agriculture Organization (FAO) har valgt ut og standardisert forskjellige mikrosatellitter i de forskjellige husdyrartene ( storfe, hester, griser, hunder, sauer, geiter) for å kunne brukes til identifiseringsstudier og for arbeid med genetisk mangfold av husdyrraser. [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]
En annen anvendelse av mikrosatellitter er konstruksjonen av mer komplette og detaljerte koblingskart; så vel som identifisering av gener av interesse (QTL-er).
Alle markører kan brukes til koblingskartlegging; det kreves imidlertid at allelene segregerer uavhengig og at de også kan overvåkes gjennom stamtavlen. Avkommet kan være informativt hvis foreldrene er dobbeltheterozygote på de analyserte lokiene. Loci lokalisert på forskjellige kromosomer kan fritt rekombinere under foreldrenes gametogenese opp til 50 % (uavhengig segregering); mens, hvis de er på samme kromosom, vil de rekombinere med en frekvens som varierer fra 0 til 50 % avhengig av avstanden i centimorgans (cM) som er tilstede mellom dem. Dermed blir et velfylt genetisk kart over markører et svært nyttig verktøy for å identifisere gener som er ansvarlige for egenskaper av interesse. Målet er å søke assosiasjon mellom ulike alleler, i hvilken som helst av markørene, segregerende i populasjoner som presenterer karakteren av interesse, for å identifisere regioner av genomet der genet som er ansvarlig for den karakteren er mest sannsynlig å bli funnet. [ 27 ] [ 28 ]
I tillegg til de ovennevnte applikasjonene kan STR-er også brukes i rettsmedisinsk etterforskning, siden en passende genetisk profil kan oppnås med en svært liten mengde DNA. Dette gjør det mulig å identifisere prøver funnet på åsteder, i tillegg til å generere en database med genetiske profiler til kriminelle som har blitt anmeldt av politiet.
Når man sammenligner to genetiske profiler, er det viktig å vurdere hva sannsynligheten vil være for at den genetiske profilen som ble funnet på åstedet kom fra en tilfeldig person i befolkningen. Dette er spesielt viktig i tilfelle du har delvise genetiske profiler, det vil si at de ikke inneholder minimum 16 STR-er som er lovfestet for mennesker. Hvis vi har en mistenkt vi ønsker å sammenligne med åsteds-DNA, må vi være sikre på at prøvene stemmer overens. Sannsynligheten for at de 16 STR-ene til en prøve faller sammen med de til en annen er 1x10^-18, noe som gir oss en ide om hvor pålitelig denne identifiseringsmetoden er.
Lovgivningen om oppbevaring og behandling av denne informasjonen varierer fra land til land, og finner tilfeller der denne informasjonen forblir i politiets mapper på ubestemt tid eller andre hvor den fjernes etter en viss tid eller når personen er bevist uskyldig. . Årsakene til at denne informasjonen kommer inn i disse databasene er også varierende, og kan legges til i det øyeblikket en person anses som mistenkelig eller venter på rettssakens løsning for å avgjøre om vedkommende kommer inn eller ikke.