Blastemet er en masse dedifferensierte celler, ansvarlige for prosesser med celleproliferasjon og redifferensiering av nye strukturer, tapt på grunn av mulig mekanisk skade (amputasjoner) under den epimorfe regenereringsprosessen. [ 1 ]
Opprettelsen av blastemet avhenger av dannelsen av individuelle mononukleære celler, [ 1 ] og krever i sin tur trofiske faktorer (vekstfaktorer), avledet fra den apikale ektodermale cap (AEC) og sårepidermis (WE). tilstedeværelsen av nerver som er i stand til å innervere blastemet, for å garantere dets overlevelse og spredning. [ 2 ]
Blastemadannelse er et viktig trinn i den epimorfe regenereringsprosessen, siden denne typen regenerering har en spesifikk sekvens der amputasjon av lemmer først skjer, deretter blastemadannelse, proliferasjon og til slutt differensiering av den fullstendig regenererte strukturen. [ 3 ] I løpet av de første dagene av amputasjonen begynner vevet nær såret en prosess med desorganisering, der cellene i periferien begynner å migrere under såret i epidermis (WE), og samler seg i midten av stubbe [ 3 ]
Det epidermale såret (WE), en struktur som består av et enkelt cellelag, er nødvendig for regenerering av strukturen, og formerer seg for å danne den apikale ektodermale hetten. Når cellene samler seg i midten av stubben, begynner de å gi opphav til blastemaceller, som til slutt vil danne den regenererte strukturen. [ 3 ]
Prosessen der blastemaceller oppstår er klassisk kjent som dedifferensiering . Dedifferensiering refererer til en prosess der en somatisk celle er i stand til å gjenopprette sin multiplikasjons- og differensieringsevne i hvilken som helst cellulær grad, gjennom bruk av forskjellige transkripsjonsfaktorer , og dermed øke potensialet. [ 4 ] Dedifferensiering involverer en rekke spesifikke serielle prosesser, som utføres av celler under prosessen med blastemadannelse. Denne serien begynner med en degradering av den ekstracellulære matrisen , som muliggjør en cellefrigjøring som gjør at stumpcellene kan gå inn i cellesyklusen igjen, med et progressivt tap av den fenotypiske spesialiseringen som er karakteristisk for celletypen. Deretter er det en endring i mønsteret av genetisk aktivitet, for å erstatte den voksne ekstracellulære matrisen med en som er nærmere relatert til den skadede strukturen. [ 4 ]
Den ekstracellulære matrisen brytes ned av sure hydrolaser som cathepsin D, sur fosfatose, β-glukuronidase, karboksylsyreesterhydrolaser og matrisemetalloproteinaser (MMP). Forhøyet uttrykk for MMP er observert under blastemadannelse. De nevnte sure hydrolasene frigjøres fra celler med skader forårsaket av mekanisk skade eller celler i døende stadier av livet. Disse enzymene har høy aktivitet, hovedsakelig i kondroklaster og osteoklaster , som fyller funksjonen med å bryte ned brusk- og benvev , og som igjen har en relativt høy overflod av strukturer under regenereringsprosesser. Når det gjelder MMP-er, er opprinnelsen til disse proteasene fortsatt ikke veldig klar, fordi de romlige uttrykksmønstrene ikke er grundig studert, og derfor er celletypene som er ansvarlige for å frigjøre stoffene ukjente. Imidlertid er det sannsynlig at makrofager frigjort i sårområdet utskiller MMP-er som fordøyer ekstracellulære matriser, og holder epitelceller sammen. Andre mulige kandidater til å utføre denne oppgaven er neurittene som strekker seg til blastemet, og muligheten har til og med blitt reist for at cellene i blastemet selv er ansvarlige for å skille ut proteasene. [ 4 ]
Under embryogenese tvinger ekspanderende neuritter seg gjennom den ekstracellulære matrisen ved å skille ut MMP-er. Makrofager frigjør likeledes MMP-er for å fordøye den ekstracellulære matrisen, uorganisert i berørt vev, og til og med epidermale celler har evnen til å skille ut MMP-er, for å kutte plasmapropper under re- epitelisering av et sår. [ 4 ] Nedbrytningen av matrisen avsluttes med differensieringen og morfogenesen til blastemacellene og syntesen av den ekstracellulære matrisen, parallelt ledsaget av tilstedeværelsen av hemmende faktorer av MMP-ene. [ 4 ]
Gjeninntreden i cellesyklusen ledsaget av tap av fenotypisk spesialisering er kun dokumentert fra studier av muskelceller (myoblaster) hos salamandere . Gjeninntreden av myoblastkjerner i cellesyklusen formidles av induktorer som serum eller forskjellige serumavledede vekstfaktorer, som fungerer som mitogener . Disse vekstfaktorene stimulerer fosforylering av retinoblastomproteinet , hvorfra E2F - transkripsjonsfaktorer dukker opp , som deretter aktiverer gener hvis produkter er essensielle for DNA-syntese . Det har imidlertid blitt funnet at de samme vekstfaktorene som stimulerer DNA-syntesen når det gjelder myoblaster svikter når de stimulerer syntesen i myotuber. Disse resultatene indikerer at når myoblastene differensierer, stopper myotubene sin respons på virkningen av de forskjellige vekstfaktorene, men uttrykker en reseptor som er i stand til å reagere på stimulansen til et annet serumprotein for DNA-syntese. [ 4 ]
Proteinet som er ansvarlig for myotubestimulering er ennå ikke identifisert, men studier som bruker fraksjoner av både myotuber og dyrkede myoblaster antyder at tilstedeværelsen av trombin er nødvendig for myotubeaktivering. Flurogene eksperimenter har vist økninger i hastigheten av trombinaktivitet når blastemet er i dannelsesfasen. [ 4 ]
Multinukleære myotuber, etter å ha blitt frigjort fra cellesyklusen, går inn i blastemet og gir opphav til prolifererende mononukleære celler, som er i stand til å differensiere til et bredt spekter av vev som er tilstede i den regenererende strukturen. Mekanismen som myotubenes kjerner induseres til å gå inn i cellesyklusen på nytt er gjennom en faktor fra serumet skapt av trombin. Trombin, som er den samme proteasen som er involvert i koageldannelse , frigjøres under mekanisk vevsskade. Denne frigjøringen skjer parallelt med utseendet av serum i såret, og når begge stoffene kommer i kontakt, dannes en faktor som er i stand til å indusere myotubene til å gå inn i cellesyklusen igjen. [ 4 ]
Denne induksjonsfaktoren forårsaket av trombin ser ikke ut til å være en global faktor mellom arter. I studier utført med musemyotuber ble det observert at kjernene til disse cellene ikke responderte på virkningen av dette proteinet, men de differensierte seg i nærvær av salamanderblastema under regenereringsprosessen. Derfor ble det konkludert med at forskjellen i respons kunne være relatert til regenerasjonskapasiteten mellom salamandere og pattedyr . [ 1 ]
Tapet av fenotypisk spesialisering skjer gjennom dårlig forståtte mekanismer. Imidlertid antas det at det kan være relatert til nedbrytningsprosessen av den ekstracellulære matrisen. Nedbrytningen av nevnte matriks utføres ved hjelp av spesifikke proteaser, som igjen kansellerer kontakten mellom molekylene lokalisert i matrisen og integrinreseptorene, forårsaker endringer i morfologien til celletypene og reorganiserer aktinet som finnes i cytoskjelettet . _ Denne omorganiseringen kan aktivere signaltransduksjonsveier som induserer regulering av enzymer, som demonterer interne strukturer til hver cellespesifikk fenotypisk. [ 4 ]
Veiene for aktivering er ikke klart fastsatt, men eksistensen av visse gener hvis produkter er relatert til initiering eller vedlikehold av differensieringsprosessen er kjent. Et av disse allment kjente produktene er transkripsjonsfaktoren MSX1 , uttrykt i stubben eller i ferd med blastemadannelse. I studier der denne transkripsjonsfaktoren ble uttrykt ektopisk, ble det observert en tydelig hemming i myogeneseprosessen, gjennom reguleringen av MyoD -genet . Imidlertid forekommer MSX1-ekspresjon bare opp til det koniske stadiet av blastemadannelse. [ 4 ]
Andre gener som muligens er relatert til differensieringsprosessen er Nrad , radikal fringe og notch . Når det gjelder Nrad , har det blitt observert at det presenterer en regulering i kjernene til myofiber i løpet av de første 4 timene etter vevsskade. rfrng uttrykkes i regenereringsprosesser bare i cellene som er tilstede i blastema, og det er også ansvarlig for å aktivere en hakk - kaskade i andre utviklingsprosesser. Tatt i betraktning at denne ruten er karakteristisk for embryonale celler og stamceller i ikke-differensierings- og proliferasjonsstadier, er det en høy grad av sammenheng i initiering eller vedlikehold av celle-dedifferensiering. I tillegg kan disse genene regulere uttrykket av den ekstracellulære matrisen syntetisert av blastemacellene, noe som vil hjelpe i dedifferensieringsprosessen. [ 5 ]
Elektron- og lysmikroskopiske studier indikerer at blastemaceller muligens oppstår gjennom dedifferensiering av myoblaster, dermale fibroblaster , bindevev og Schwann-celler . Disse stamceller befinner seg noen få millimeter fra sårplanet der regenereringsprosessen vil finne sted. Derfor kan det utledes at regenereringsprosessen ikke kan utføres ved å sirkulere celler fra områder fjernt fra amputasjonsstedet, eller av aktiverte stamceller på et sted fjernt fra amputasjonsstedet. I tillegg, fra amputasjonsstudier av lemmer i salamander, er det kjent at stamceller har evnen til å vedvare, selv i strukturer som tidligere ble regenerert, noe som viser at stamceller fornyes i de modne strukturene til individer. . [ 3 ]
Det er to typer blastema-cellepopulasjon. Den første tilsvarer de udifferensierte mesenkymalcellene i stubbens distale region, hvis funksjon er relatert til vekst og formasjonsmønster. Under utviklingen av en lem, er denne befolkningen lokalisert i en region som kalles "fremskrittsregionen". Den andre populasjonen består av celletyper som har migrasjonsmønstre mot strukturen under dens regenerering. Denne migrasjonen formidles av posisjonelle signaler levert av celler i den første populasjonen. Disse cellepopulasjonene har aktive roller under utvikling av lemmer. Celler fra den første populasjonen er kjent for å bidra til dannelsen av binde- og skjelettvev, mens celler fra den andre populasjonen er forløpere til blodårer , myoblaster og nervefibre . [ 6 ]
Til tross for vissheten om at visse stamceller er i stand til å stamme fra blastemaceller, var deres opprinnelse stort sett ukjent. Bevisene funnet i studier av regenerering av salamanderlemmer pekte på det faktum at alt vevet i det modne lemmet bidro med celler som gjennomgikk differensieringsprosesser for dannelsen av blastema, og deretter til fullstendig regenerering av den tapte strukturen. Nye bevis funnet fra studier utført med tidligere markerte vevstransplantater indikerer imidlertid at deltakelsen av celletyper presenterer et hierarki og ikke en rettferdig oppførsel i prosessen med blastemadannelse. [ 3 ]
Det cellulære bidraget til blastemet er angitt nedenfor.
Den regenererte strukturen inneholder både nerver og blodårer, som er sammenhengende med mer proksimale strukturer i stubben. Det tidlige blastemet ble tidligere antatt å ha dårlig vaskularisering , med blodårer som vokser distalt i mer utviklede stadier avledet fra eksisterende kar i stubben. Imidlertid har det blitt observert at vaskularisering er en prosess som skjer mye tidligere i blastemastadiene, hvor blodårene er avledet fra karceller som er påvirket av skaden i områder mye mer proksimalt til stubben. [ 3 ]
Ved amputasjonstidspunktet har de eksisterende aksonene i stubben en tendens til å trekke seg sammen et kort stykke proksimalt, før regenereringsprosessen startes og det tidlige stadiet av blastema og overliggende epidermis innerveres. Fordi cellene til aksonene som er tilstede i blastemet finnes i sentralnervesystemet , anses ikke disse cellene som celler som tilhører noen av de tidligere nevnte populasjonene av blastemaceller. Men i det øyeblikket aksonene trekkes sammen på grunn av effekten av amputasjonen, etterlater de rester av omgivende bindevev, sammensatt av fibroblaster og Schawnn-celler. Disse prolifererende cellene bidrar aktivt til dannelsen av blastemet og har i tillegg nære assosiasjoner til aksonene som blir regenerert, for å omforme nerveskjeden i lemmen. [ 3 ]
Derfor kan det konkluderes med at blastemaproliferasjon avhenger av tilstedeværelsen av nerver, siden nevroner har evnen til å frigjøre faktorer som øker blastemacelleproliferasjonen. [ 1 ]
Skjelettelementene som utgjør stubben avhenger utelukkende av posisjonen til strukturen. Denne konformasjonen kan gis av bindevevet (fibroblaster), eller kondrocyttene og perichondriale celler eller osteocytter, og de periosteale cellene. Imidlertid er bindevevet den strukturen som gir det største bidraget til dannelsen av blastemet og dets påfølgende regenerering. I studier utført hvor bindevevet rundt skjelettelementene ble fjernet, ble det observert et mye mindre mønster av blastemadannelse enn da det var tilstede. I tillegg ble det funnet bevis for at skjelettvevet til et amputert lem kunne presentere blastemadannelse og regenerering, fra bare fibroblastelementer, noe som bekreftet den lave deltakelsen av skjelettelementer i regenereringsprosessen. [ 3 ]
Fordi muskel har flercellede lag med celler av forskjellig opprinnelse, er opprinnelsen til de blastema-dannende stamceller ennå ikke klar. Muskelvevslag er komplekse lag, som har ulike celletyper, som nerveassosierte Schawnn-celler, myofiber, bindevev eller fibroblaster, og stamceller som er tilstede i muskler, inkludert satellittceller eller post-satellittceller. Det er bevis på en cellelinje kalt A1, i stand til å danne myotuber in vitro . Disse flerkjernede myotubene, når de settes inn i blastemet, går inn i cellesyklusen igjen når de stimuleres med serum, og fragmenteres til mononukleære blastema-dannende celler. [ 3 ]
I tillegg til mononukleære celler avledet fra multinukleære myoblaster, bidrar også post-satellittcelleprogenitorer til muskelregenereringsprosessen. Satellittceller er myogene stamceller som er tilstede under den ytre lamina av skjelettmuskelfibre . Disse cellene reagerer på skade ved å inkorporere 3H-tymidin , og ved å proliferere og smelte sammen for å danne myotuber, ved å bruke en cellulær mekanisme som ligner på A1-linjen. Til tross for det relative cellulære bidraget til de to hovedkildene som er angitt, er det tydelig at cellene som bidrar til dannelsen av blastemet er tilstede i det eksisterende vevet i den berørte strukturen. [ 3 ]
Bindevevsdannende celler i dermis og proksimale muskler, nerver og blodårer kalles samlet fibroblaster . Fibroblaster er de cellulære elementene som har størst innflytelse på regenerering, både når det gjelder cellebidrag på tidspunktet for dannelse av blastemet og i kontroll av vekst og dannelsesmønsteret til den nye strukturen. Dermal fibroblastavkom utgjør 19-78 % av cellene i tidlige stadier av blastemadannelse. [ 3 ]
Spredningen av blastemaceller avhenger av tilstedeværelsen av nerver, da nevroner er ansvarlige for å frigjøre faktorer som øker potensialet for spredning. En av faktorene som frigjøres er glial vekstfaktor . Denne faktoren er avgjørende for å opprettholde en høy grad av spredning i blastemacellene. En annen viktig faktor er fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2), tilstede i aksonene som innerverer lemmen, som spiller en kritisk rolle under spredning. FGF2 fyller tilleggsfunksjoner i tillegg til regenerering. Det kan primært fungere som en angiogenesefaktor, fordi blodtilførsel er nødvendig og utviklet ved å regenerere vev like etter at vevsskade har oppstått. For det andre virker denne faktoren som et stimulerende middel for mitose og setter mønsteret til det regenererende lemmet. Spredningen av blastemaceller avhenger imidlertid ikke kun av de tidligere nevnte faktorene. Denne spredningen krever også metabolske effekter som skilles ut av endokrine hormoner , spesifikke faktorer avledet fra AEC, og nerver som er tilstede i blastema-sonen. [ 7 ]
Selv om cellene i epidermis ikke har et direkte bidrag til dannelsen av blastema, spiller den spesialiserte cellebelegget i den apikale epidermis en kritisk rolle i regenereringsprosessen. Disse cellene tillater vekst, og kontrollerer i sin tur dannelsesmønsteret i utviklingen av nye lemmer. Det er bevis på at endringer eller fjerning av WE eller AEC dramatisk endrer regenereringsprosessen ved å avbryte kontakten mellom den apikale epidermis og den blastemadannende stubben. Ekspresjonen av en serie gener i celler lokalisert i stubben er sterke bevis på den nødvendige interaksjonen mellom disse strukturene under regenereringsmekanismen. Siden ekspresjonen av disse genene ikke forekommer i celler ved siden av kontaktpunkter mellom disse cellelagene, er det antagelig at signalenes natur har et kort ekspresjonsområde og krever en tilnærming av cellelagene som er involvert. [ 3 ]
Selv om den medierende mekanismen til signalene uttrykt i stubben og epidermis ikke er klart fastsatt, antas det at vekstfaktorene FGF er viktige under regenereringsprosessen. Mange vekstfaktorer har vist ekspressivitet i regenerering, som er tilfellet med fgf4, fgf8 og fgf10. Disse faktorene er hovedsakelig involvert i spredningsmekanismene, men det har blitt oppdaget at de også deltar som kjemoattraktanter og stimulerer migrasjonen av celler fra toppen av ekstremitetene mot den apikale epidermis. Tatt i betraktning at en av de første cellulære hendelsene i regenerering er migreringen av dermale fibroblaster og andre distale celler fra stubben mot WE, kan FGF-er være ansvarlige for å sende ut tidlige signaler involvert i tidlige cellemigrasjonshendelser. Videre, fordi spredning går foran migrasjon, antas det at spredningshastigheter avhenger av posisjon og cellekontakt som stammer fra nærhet til den apikale epidermis og signaler avledet fra den. [ 3 ]
Molekylære og genetiske bevis indikerer at spesifikasjonen av den distale regionen er en konsekvens av det samtidige uttrykket av 3'- og 5'-medlemmene av Hox a- og Hox d -kompleksene . Det tidlige uttrykket av Hox a13 og Hox d9 i stumpceller antyder at en av de første hendelsene i regenerering er etableringen av den distale spissen, uavhengig av amputasjonsnivået. Tidlig etablering av den distale spissen sikrer at det regenererende vevet alltid er en nøyaktig erstatning for den delen av mønsteret som er fjernet ved amputasjon. I tillegg signaliserer det distale blastemet den proksimale stubben, og oppmuntrer til spredning og regenerering av de manglende mellomstrukturene. [ 3 ]